Paraspeckles: Where Long Noncoding RNA Meets Phase Separation

长链非编码RNA在基因的表达调控中，起着重要的作用。精确的RNA和蛋白质互作模型来研究RNA和蛋白质之间的相互作用以及相分离模式是必不可少的。而目前的大多数将此项研究聚焦在核体Paraspeckle上。这种无膜细胞器是在一种特殊的LncRNA作为骨架，然后将蛋白质富集在核器上。新的研究表明Paraspeckles 是如何通过多种RNA和蛋白质以及蛋白质蛋白质互作形成核器的，而这种互作，涉及广泛多聚化的形成，其他的多种共价互作可以去驱动相分离的形成。一旦形成，这种Paraspeckles结构通过滞留RNA和蛋白质等成分，使其在另一个区室被耗尽。从而调控细胞基因的表达。这篇文章，作者聚焦Paraspeckles的结构和功能。

洞察Paraspeckle长链非编码RNA的结构和功能以及无膜细胞器的形成

动态无膜细胞器的形成一直备受科学家的关注，是什么触发这种结构的形成，多种特异的分子是如何聚集在这里的，这种结构如何维持这种稳定的状态，又是什么物质触发他们迅速的崩解?核质中存在大量的这些无膜的细胞器，通常被称为核体，这些核体能够调节基因的表达，尽管这种机制并没有完全被解析。LncRNA的功能以及其与蛋白质的互作，还有如何操纵这种互作已经得到了很多精确的解析。然而无膜细胞器和LncRNA生物学在细胞核领域，作为一个重要的模式体系 Paraspeckles 有特异的LncRNA参与的核体。

近些年的研究表明，Paraspeckle的形成依赖于特异的LncRNA的种子序列招募特异的蛋白质成分，从而发生那个蛋白质与RNA的互作，从而在细胞核的特定位置形成局部高浓度。
一旦与它们的骨架LncRNA 结合，这些蛋白质发生寡聚化，并且招募其他的含有LCD（Low complexity Domain) 蛋白质介导液液相分离的过程并且形成Paraspeckles。尽管这种结构是液体的形状，但是证据表明在这种结构里存在亚细胞结构。高分辨率的显微镜表示，这种结构存在核心和躯壳两个部分，另外我们对于这种LncRNA种子体在不同的生理环境下尤其是在癌症和细胞压力应激下如何以动态的方式调节基因表达有了新的理解。本综述总结在Paraspeckle在近期中的一些发展。

Paraspeckle 是什么?
Paraspeckle 是哺乳动物特殊的RNA和蛋白质组成的核体他们参与基因的表达调控。第一次在2002年被发现。其中的PSPC1是Marker蛋白，截止目前的研究表明，Paraspeckel大约有40中RNA结合蛋白组成以及结构的LncRNA构成NEAT1。一些成分蛋白质介导至关重要的RNA和蛋白质的互作以及蛋白与蛋白的互作对于paraspeckle的形成是必不可少的。除了集中必要的结构成分之外，也有其他的几种不同的分子靶向Paraspeckle(PS)。比如说多种RNA 和蛋白质，它们不参与构建PS，但是能够调控他们。

在多种培养的细胞中PS的大小和丰度不同，包括多种初级和转换的细胞系，但是在ESC和iPSC细胞中并不存在，PS在多种细胞组织中存在。但是多数的PS在小鼠的组织的某些亚细胞群中找到，比如说卵巢中的黄体细胞和肠上皮末端细胞。

尽管最初PS被认为是PSPC1的富集地，但随后的si敲低实验表明，PSPC1对于PS的形成并不是必要的另外两种蛋白NONO 和SFPS以及其他的几种蛋白(HNRNPK,DAZAP1,FUS,RBM14,HNENPH3)对于PS的形成是必要的,这些蛋白在Hela细胞的敲除，导致PS难以形成。考虑到PS标志蛋白的这种看似微不足道的作用，在这里我们提出PS的明确定义：一种核体，其中一种基本的PS蛋白与NEAT1的较长异构体的共定位。

长链的NEAT1的异构体是PS的结构骨架。
LncRNA作为蛋白结合的骨架，是PS的必要结构成分

NEAT1由基因组转录得到两个转录本，一个是NEAT1_1,另一个是NEAT1_2，两者在5末端能够完全的重合，两个转录本都含有一个外含子并被
滞留在细胞核中。NEAT1-1以类似于mRNA的方式被多聚腺苷酸化。而NEAT1-2在3末端具有不同寻常的三级螺旋结构，这被认为是此类LncRNA的特征。NEAT1-2是PS的重要成分，NEAT1-2能够形成PS的骨架，在NEAT1敲出的小鼠里，不能形成PS，但是只有当过表达NEAT1-2之后，PS才能重新形成。
对于NEAT1-2的形成的了解是必要的，NEAT1-2的转录是切割因子之间的竞争导致的，否则这些因子通过必要的PS蛋白HNRNPK参与NEAT1-1的切割和腺苷酸化。NEAT1-1的polyA位点的突变也能够模拟这种效应，在缺乏转录终止因子和切割产生了NEAT1-1的情况下，RNA聚合酶2能够基序转录产生更长的NEAT1-2。除了起始的NEAT1-2的种子事件，活性转录的NEAT1-2对于PS的形成和维持是必要的，表明存在顺式互作的因子能够感知NEAT1-2的产生。然而对于NEAT1-1在PS形成中的作用还有待进一步的深究，新的研究表明器可能不参与PS的形成。考虑到NEAT1的异构体的差异，我们建议研究者在进行实验的时候，不应该假设NEAT1-1的过表达或在当NEAT1-2不存在的时候，假设NEAT1-1的敲除，这些必定会影响PS的形成。

PS是球状的链体结构。每个都含有一个核核一个躯壳。用荧光蛋白可以标记PS的Marker蛋白和RNA。在电子显微镜下也可以区分染色质空间致密的结构。尽管最开始被认为式点状的斑，EM和超分辨显微镜表明PS作为一个细长的扁长结构，在人的细胞中的均匀宽度在360nm，而在小鼠的细胞中有1-2mm。PS的长度和数量与NEAT1-2的数目之结成正比例随着NEAT1-2的水平的增加，PS的长度和数目越多。

荧光原位杂表明，该23000个的核苷酸的RNA的5末端和3末端位于躯壳外部，则RNA的中心则位于核内，将不同的核酸探针组合到NEAT1-2的3和5末端，可以发现RNA的端部不仅单独聚集，而且还是成束。免疫荧光显示几种蛋白质定位于几个显著不同的位置。NONO，SFPQ和FUS定位于核，RBM14核BRG1定位于核斑，而TDP43定位于NEAT1的5末端核3末端。尽管这种超微结构见解在很大程度上是描述性的，但它们的确为旨在了解该亚结构如何在PS生物发生中建立的研究提供了关键框架。

PS的形成
PS的发生起始于NEAT1-2，而PS的形成靠近
于NEAT1基因，并且经常出现在该基因座附近，NEAT1-2生成后，NONO蛋白和SFPQ迅速结合来稳定最小的NEAT1-2RNP颗粒，这是PS形成的中间产物。对于NONO和SFPQ结合的NAET1-2的具体位点还不清楚，但是免疫交联沉淀结果表明蛋白质于NEAT1-2的序列广泛结合，于此同时NONO 和SFPQ蛋白中存在经典的RRM结构域这些结构在PS形成中非常重要。起始的RNA和蛋白质互作的种子是按触发勒NONO和SFPQ沿着RNA的多聚化，确实NONO 和SFPQ的卷曲结构形成勒广泛的聚合物，这些聚合物对于PS的完整性很重要。而保守的带电荷的单个a螺旋区域很可能参与这些蛋白沿NEAT1-2分子间距离的贡献。RNA和LCD区域对于NEAT1-2的稳定性很重要。
另外一种核心蛋白质FUS对于NONO SFPQ以及RNA的链接形成成熟的PS是重要的。 RBM14和swi/snf成分BRG1是两种桥接斑和核心以及躯壳的重要蛋白，这两种蛋白利用必要的蛋白质蛋白质互作来形成PS。然而BRG1并不需要他的ATPase的活性对于器在此结构中的作用。

液液相分离对于PS的形成至关重要
PS在很大程度上和细胞质的压力颗粒SG的性质很像。另一种的无膜细胞器。PS和SG两者含有共有的蛋白质成分在压力下，变得更加丰富，通过分子滞留产生功能，并且两者在核区和外壳区域有不同的亚分子。作者认为这种无膜细胞器结构更多的来说，具有液体的性质，更像液液相分离。蛋白质的LCD区域以前被认为是灵活的连接子或无法折叠的区域，它们可以骄傲而到蛋白质的液液相分离。这些蛋白质的据集，可以导致一系列的状态，从单体到液体，在到含有交叉β相互作用的淀粉样纤维状的结构，然而并不像病理条件下的β淀粉样的结构，这种纤维结构能够很快的崩解，这种纤维结构能够形成水凝胶，核体长久的被观察到有液体一样的性质涉及融合和分裂。在几乎所有的PS蛋白中这类LCD类的结构域参与纤维的形成，Prionlike(PL）样的结构域富含不带电荷的极性氨基酸谷氨酸，酪氨酸以及甘氨酸。其他的负责蛋白质之间的互作，2/3的PS蛋白含有PL结构域，表明PL结构域在介导PS的形成中广泛的存在。实验研究表明两种必要的蛋白质RBM14和FUS蛋白需要完整的LDC结构域参与PS的形成。

PS的分子功能的机制
PS一旦形成后，他的功能是什么?对于PS目前的功能，主要是将RNA或者蛋白质分子滞留在核区。
除了NEAT1，其他类型的RNA可能定位在PS，并且PS可能潜在的受到这些RNA的调控。这些被滞留在细胞核的RNA中，最具特征的一类含有通过转录的反向重复序列形成的双链RNA结构[35]。这种核滞留机制是由与RNA中双链RNA结构结合的NONO和SFPQ驱动的。最近的研究表明，NONO螺旋区的甲基化对调控其结合这些双链rna的能力很重要[36]。

PS能够定量的扣留它们的组分蛋白，从而参与调控基因的表达，随着NEAT1-2的水平的增加PS的结构越来越大，于此同时招募的组分蛋白也越来越多，比如说SFPQ这种蛋白，在PS结构中的大量聚集，使得SFPQ蛋白在核质中的浓度降低，从而调控相应的基因的表达，比如在正常的情况下，SFPQ能够体抑制IL-8的表达激活ADARB2的表达，当核质中的SFPQ的表达含量降低，将会影响这两种基因的表达。对于PS来说，SFPQ是进行这项详细研究的唯一分子，但据推测，所有PS蛋白都将通过以类似方式改变PS的大小来调节。众所周知，其他核器也有类似的亚核隔离机制。例如，由SPA-lncRNA（具有50个小核仁RNA帽和30个聚腺苷酸）种子的核体捕获并消耗核质中其他特定RNA结合蛋白[39]。

PS在转录核miRNA处理过程中的作用
PS还可能与转录活跃基因的转录起始位点对接，一项研究通过CHART(capture hybridization analysis of RNA targets) 表明NEAT1 RNA在乳腺癌细胞系中可以与活性转录的基因转录起始位点结合。此外SFPQ核NONO近期被发现在前Pri-miRNA的处理过程中起作用增强内含子包含的pri-miRNA的处理过程从而促使miRNA的成熟。通过将SFPQ和NONO以及洽谈的一些miRNA处理过程中的相应的因子，滞留在细胞核PS里，从而对miRNA的成熟的过程起积极作用。

在发育和疾病过程中，PS起重要的作用

在许多的RNA病毒感染后，导致PS的水平增加，同时NEAT1-2的水平也有所增加。在多数情况下，证据表明NEAT1-2/PS作为一种细胞防御机制而增加，更丰富的PS导致PS蛋白的隔离增加，从而防止病毒对这些蛋白的使用劫持，从而有助于细胞的基因调控的变化。

Paraspeckle 是癌症的敌人还是朋友?
尽管很多的研究表明NEAT1分子与许多的癌症有关，但是并没有直接将PS和NEAT1-2与癌症生物学联系起来，癌症里对NEAT1-2进行meta分析表明NEAT1-2的表达模式的变化和复杂性，表明NEAT1在肿瘤和癌旁组织中存在上调，下调和不变的情况。取决于不同的癌症模型和研究，在大多数的研究中，在NEAT1的两个异构体中不存在差异。尽管如此，PS在癌症中还是起着重要的作用，NEAT1基因，包括NEAT1-2在肝癌病人中，发生着大量的突变。近期在乳腺癌病人中发现NEAT1基因启动子处存在热带突变，总之几种不同的癌症类型中存在NEAT1-2的上调突变。由癌前或肿瘤细胞应激诱导的NEAT1/paraspeckles是一个共同的主题。然而，在许多这样的情况下，只有当应力作用于细胞时，功能才是明显的。

在许多情况下，PS作为原癌基因的角色在乳腺癌中，因为HIF诱导的NEAT1-2的增加，引起了PS的增加，在胰腺癌中NEAT1-1/2以及PS的水平，能够促进癌症的高级进展。在这种情况下，ER能够促进NEAT1的转录。NEAT1和ER能够促进增值相关基因的转录。在皮肤成纤维细胞中，p53在癌前细胞转化为肿瘤时有道NEAT1和PS的产生，无论是在遗传性还是在局部皮肤癌的小鼠模型中，NEAT1的丢失阻止了这种转化，这表明NEAT1是一种有效的癌基因，在这项研究中，NEAT1和PS可以防止复制应激，帮助DAN损伤反应。