- 根据DNA marker看条带大小
- 看条带大小是否与目的条带的大小一致
- 看根据条带亮度推测DNA量
- 看PCR引物是否特异,即是否有杂带
- 看是否有引物二聚体判断引物的好坏
- DNA凝胶电泳标准琼脂糖浓度一般为1.0%。
浓度越高,小条带的分辨率越高
;琼脂糖浓度越低,大分子量条带的分辨率和分离程度越高
。 - 电场中,中性pH值缓冲液(TAE/TBE)下
DNA带净负电荷
并向凝胶装置正极(+)
移动(下图中,上为“-极”至下为“+极”),DNA分子越大所受阻力越大
,迁移越慢,500bp的DNA分子比200bp的DNA分子迁移慢。负电荷的磷酸集团。 - 电泳时需
将DNA与荧光染料混匀
,结合染料后,DNA在紫外灯下发出荧光
,才会出现亮色条带,常用染料有EB(溴化乙啶
)、gel red、sybrgreen1等(有钱建议不要用EB,有毒)。溴化乙锭等类似的核酸染料一定控制好用量
(注意Gelred或者Gelgreen核酸染料更要控制用量,Gelred由两个溴化乙锭分子拼接,而Gelgreen由两个SYBR Green分子拼接,显色灵敏度或许更高,但嵌入核酸分子中后的阻力也更大
),按说明书标准使用,切忌随意。 - 电泳结果解读,无法直接判断DNA长度,需要在电泳过程
将DNA产物与DNA标准品(DNA Marker)
一起电泳,DNA Marker里面含有若干种长度已知的DNA
(下图中出现6条亮带的就是DNA Marker),与之比较可以粗略判断DNA样品的长度
。DNAMarker中的DNA片段浓度已知
,与DNA Marker的亮度比较初步判断DNA样品浓度
。 - 结果解读:与DNA Marker比较,
野生型
是左
边这个图,DNA片段长度大小约200bp,突变型是右边,突变有纯合突变和杂合突变
,500bp的条带即纯合突变,最右200bp及500bp两条条带即为杂合突变。
DNA电泳技术分离时影响其迁移速率的因素
:
- DNA的分子大小
- 琼脂糖浓度
- DNA分子的构象。
相同分子量的线状、开环和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的,超螺旋DNA移动最快,而开环双链DNA移动最慢。
- 电源电压。在低电压时,线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比
- 嵌入染料的存在。染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA,使其刚性更强,
使线状DNA迁移率降低15%
。 - 离子强度影响。电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率
分子生物学实验:https://max.book118.com/html/2016/0302/36634240.shtm