将获得的病原菌进行寄主回接,
完成柯赫氏法则的验证。
观察实验室寄主发病症状与田间发病症状是否保持一致,验证发病的寄主中分离的病原菌与接种病原菌是否一致,并记算病原菌的致病力。
具体操作如下:
催芽
:选取饱满的种子,用
55°C
无菌水浸泡种子
2 h
后,把种子放在底部铺有湿润纱布的保湿盒中,置于
28°C
的恒温箱中进行催芽,备用。
菌种培养
:将保存的菌种在
PDA
平板上活化后,
转接至
PD
液体培养基中,放在摇床上
28°C
振荡培养
7 d
,用于菌悬液的制备。
菌悬液的制备
:将在
PD
液体培养基中培养好的菌株用双层纱布过滤除去菌丝,
5000 rpm
离心
10 min
后,弃上清液,取沉淀物加入适量的蒸馏水,再用血球计数板将菌悬液调配成浓度为
1 ×106 mL-1
的孢子悬浮液备用。
接种方法有以下
3
种:
伤根灌根法:
待蔬菜苗长至
2~3
片真叶时,利用灭菌牙签对植株侧根进行损伤,在伤口周围
1 cm
处扎一约
3~4 cm
的小穴,沿小穴灌入
10 mL
的菌悬液,以灌入
10 mL
的无菌水的植株为清水对照。
蘸根接种法
:蔬菜幼苗在一叶一心时,拔出幼苗,洗去泥土,将根部稍加损伤,在接种液中浸泡
15 min
并不断摇晃,最后定植在消毒土中。对照处理用无菌水浸泡根部
15 min
并不断摇晃,最后定植。
胚根浸种法
:种子出芽长
2~3 mm
左右时进行接种,将胚根长度一致的种子置于小烧杯内,注入菌悬液,浸泡
30 min
后倒去菌悬液,立即播种于装有灭菌土的塑料钵内,覆土。对照处理用无菌水浸泡
30 min
后,立即播种,覆土。
试验一般设置
3
次重复,每个重复设
10
个处理。接种后,每天观察植株的长势和发病情况,及时记录并采集症状图像。
待植株发病后,完成柯赫氏法则的验证,确认分离得到的镰孢菌为导致蔬菜根部病害的致病菌。
根据调查结果分析病害的发病程度并计算病情指数,病害评估标
准和病情指数公式
2-1
如下:
0
级:无病症
1
级:真叶或子叶上出现轻微萎蔫,但生长正常
2
级:
真叶或子叶上出现明显的坏死斑,
根部出现病变,生长受到一定影响
3
级:
根部坏死引起局部性萎蔫,或生长僵化
4
级:
整体萎蔫,
倒伏枯死,根部严重病变
病情指数
=[∑(
各级病株数
×
相对级数值
)/(
总株数
×
最高级数代表值
)]×100