1. 细胞周期

• 细胞周期分为间期和分裂期，间期包括 G1 期、S 期、G2 期。
  △ G1 期：DNA 合成前期，合成 RNA 和蛋白质，为 DNA 复制做准备；
  △ S 期：DNA 合成期，DNA 复制，合成组蛋白与 DNA 形成染色质，合成 DNA 复制所需的酶；
  △ G2 期：DNA 合成后期，DNA 合成终止，合成 RNA 和蛋白质，为有丝分裂做准备。
  △ M 期：细胞分裂期。
  

• 在细胞周期的各个时期，DNA 的量都有所区别，可通过检测 DNA 含量确定细胞所处的时期。
  △ G0-G1 期：2N；S 期：2N ~ 4N；G2-M 期：4N。
  △ PI 染色：核酸染料给细胞内的 DNA 染色，从而检测 DNA 的量以确定细胞周期；

• 2 个关键的 check-point 细胞周期检验点：
  △ G1/S check-point：调控细胞从静止状态进入 DNA 合成期，检验分裂后的细胞是否足够大，G1 期合成的 RNA、蛋白质和糖等是否充足，是否有生长因子调控，DNA 是否有损伤，能否启动 DNA 的复制，防止有损伤或突变的细胞进入 S 期，并启动相应的信号通路进行损伤修复（如 ATM/ATR，Chk1/Chk2 信号通路，人类还特有 p53/p21 信号通路，启动 SOS 修复）。
  △ G2/M check-point：是决定细胞一分为二的控制点，作用是使得细胞有充足的时间将损伤的 DNA 得以修复。主要检测 DNA 是否损伤细胞中合成的物质是否够多，细胞的体积是不是足够大，如果细胞不够大是无法有丝分裂的。如果能够通过这个检查点，细胞内的染色体就能收缩，开始有丝分裂；如果不能通过，细胞就会暂停，启动 DNA 的损伤修复等机制。如果在复制的过程中，损伤没有得到修复，在 G2/M 检验点依然会启动 SOS 修复。

• 1 条关键的信号通路：调控细胞周期的 Cyclin-CDK-CKI 信号通路，可以根据该信号通路中分子 marker 的表达量和磷酸化状态以及分子 marker 之间的相互作用确定细胞所处的时期。
  △ CDK 在整个细胞周期内表达相对恒定；
  △ Cyclin：细胞周期蛋白，有 CyclinA、B、D、E、G、H，每大类又分亚类，用数字表示（如 CyclinD₁），在整个细胞周期中周期性表达。
  ◆ Cyclin 与 CDK 结合形成复合物，激活 CDK 的激酶活性，达到在不同时相精准调控细胞周期的功能。
  → G1 期早期 CyclinD₁开始表达，CyclinD 与 CDK4/6 结合形成复合物，使 CDK 的 172 位酪氨酸残基发生磷酸化，激活 CDK 的激酶活性。
  → G1 期中期 CyclinE 表达升高始于 G1 中期，至 G1 晚期的 G1/S 交壤处达顶峰，细胞进入 S 期后，cyclin E 开始下降，到 G2/M 期降为零。因此 cyclin E 主要作用于 G1 晚期、S 期开始之前，调控细胞从静止细胞 GO 期或 G1 期通过限制点“R”(point of no return) 进入 S 期。CyclinE 与 CDK2 形成复合物，使 Rb 蛋白发生磷酸化而失活（G1 期之前，Rb 蛋白是非磷酸化的）。
  → S 期和 G2 期， CyclinA 在 S 期达到峰值，与 CDK2 形成复合物。
  → G2 晚期和 M 期，CyclinB 能与 CKD1 形成复合物。
  

• WB 检测这些分子 marker 的表达量和磷酸化状态，也可以通过 CoIP 检测这些分子是否能相互作用来判断细胞处于细胞周期的哪个时期。

• 磷酸化蛋白的 WB 相对于普通蛋白的 WB 需要注意：
  ① 需要在冰上抽提蛋白，裂解液中要加磷酸酶抑制剂；
  ② 一裂解充分就立刻抽提，可以用摇床加速裂解；
  ③ 转膜后的封闭液不能用牛奶，牛奶中含磷酸酶，会干扰结果，而是用 5%BSA 来封闭，要控制封闭时间。

2. 检测细胞周期：PI 染色

PI 染色检测细胞周期的原理

• PI (propidium iodide)，碘化丙啶，是一种核酸染料，既能染 DNA，也能染 RNA，能发出红色荧光。
• PI 不能通过细胞膜完整的细胞 （如活细胞和早期凋亡细胞） , 在标本制备时 , 必须先用乙醇或其他破膜剂增强细胞膜的通透性 , 才能使 PI 进入细胞内与细胞内的核酸结合。
• 需要先将 RNA 去除以排除 RNA 的干扰。
• PI 与 DNA 结合后，可以使用流式细胞仪收集 PI 发出的红色荧光信号，以荧光反映 DNA 含量。
• 适用于检测培养的细胞，不适用于检测组织样本。
• 参考：PI 染色法检测细胞周期

PI 染色检测细胞增殖的操作流程

1. 消化收集细胞：将处理好的细胞样品组用含 EDTA 的 0.25%胰酶消化细胞呈单细胞悬液，DMEM+10%FBS 终止消化后，将单细胞悬液加入 2ml 圆底离心管中，1500rpm 离心 5min 沉淀细胞，弃上清。
2. PBS 洗：加入 1ml 预冷的 PBS 重悬细胞沉淀， 1500rpm 离心 5min，弃上清，以充分去除残留的 FBS 和胰酶。
3. 固定：加入 2ml -20℃预冷的 70%乙醇重悬细胞沉淀（加乙醇时应注意边加入边轻柔吹起细胞，放置固定时细胞结成团，难以吹散而影响后续的检测），4℃固定 30min 或 -20 ℃固定过夜后， 1500rpm 离心 5min，弃上清，去除残留的乙醇。
4. PBS 洗：加入 1ml 预冷的 PBS 重悬细胞沉淀， 1500rpm 离心 5min，弃上清后， 500ul PBS 重悬细胞。
5. RNA 去除：加入 RNase A（工作浓度 20μg/ml），37 ℃孵育 30min，充分降解细胞内 RNA，后 1500rpm 离心 5min，弃上清。
6. PI 染色：500μl PBS 重悬细胞沉淀，加入 25ul PI 染液（工作浓度 50μg/ml），冰上放置避光孵育染色 30min。
   PI 推荐： eBioscience 00-6990 （按说明书 5μl PI 加入 100μl 细胞）
7. 流式细胞仪检测：染色后的细胞过 300 目筛，置流式管中上流式细胞仪检测，如果暂时不能检测 4 ℃ 冰箱保存待测。

PI 染色检测细胞周期实验分组设计

• 除了空白对照、阴性对照、实验组，还需要准备未染色的空白细胞，用于流式细胞仪检测时调背景参数等。
• 独立重复做 3 次。

数据处理与绘图

• 使用专用软件分析流式数据（可以使用 FlowJo），得到细胞周期比例。
• 将 3 次独立重复的数据都分析完后进行统计分析并绘制柱状图。
• 参考：
  FlowJo流式数据分析基础——常见术语
  Flowjo分析细胞功能实验数据